PCR, የ polymerase chain reaction ነው, እሱም የዲኤንቲፒ, Mg2+, የመለጠጥ ምክንያቶች እና በዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዜዝ ስር ያለውን ስርዓት መጨመርን የሚያመለክት, የወላጅ ዲ ኤን ኤ እንደ አብነት እና የተወሰኑ ፕሪመርቶችን እንደ የቅጥያ መነሻ ነጥብ በመጠቀም, በ denaturation, annealing, ቅጥያ, ወዘተ ደረጃዎች, በብልቃጥ ሂደት ሴት ልጅ ስትራንድ ዲ ኤን ኤ ማሟያ ከወላጅ ስትራንድ አብነት ዲ ኤን ኤ ጋር በፍጥነት እና በተለይ ማንኛውም ኢላማ ዲ ኤን ኤ በብልቃጥ ውስጥ ማጉላት ይችላሉ.
1. Hot Start PCR
በተለመደው PCR ውስጥ የማጉላት የመነሻ ጊዜ የ PCR ማሽንን ወደ PCR ማሽን ውስጥ ማስገባት አይደለም, ከዚያም ፕሮግራሙ ማጉላት ይጀምራል.የስርዓት አወቃቀሩ ሲጠናቀቅ ማጉላት ይጀምራል, ይህም ልዩ ያልሆነ ማጉላት ሊያስከትል ይችላል, እና ትኩስ ጅምር PCR ይህንን ችግር ሊፈታ ይችላል.
ትኩስ ጅምር PCR ምንድን ነው?የምላሽ ስርዓቱ ከተዘጋጀ በኋላ የኢንዛይም ማሻሻያ በከፍተኛ ሙቀት (ብዙውን ጊዜ ከ 90 ዲግሪ ሴንቲግሬድ በላይ) በመነሻው የሙቀት ደረጃ ወይም "ትኩስ ጅምር" ደረጃ ላይ ይለቀቃል, በዚህም ምክንያት የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬዜሽን ይሠራል.ትክክለኛው የማግበሪያ ጊዜ እና የሙቀት መጠን በዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ተፈጥሮ እና በሙቅ ጅምር መቀየሪያ ላይ የተመሰረተ ነው.ይህ ዘዴ የዲኤንኤ ፖሊመሬሴን እንቅስቃሴ ለመግታት በዋናነት እንደ ፀረ እንግዳ አካላት፣ አፊኒቲ ሊጋንድ ወይም ኬሚካል ማስተካከያዎችን የመሳሰሉ ማሻሻያዎችን ይጠቀማል።የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ እንቅስቃሴ በክፍል ሙቀት ውስጥ የተከለከሉ ስለሆነ የሙቅ ጅምር ቴክኖሎጂ የ PCR ምላሾችን ልዩነት ሳያስወግድ በክፍል ሙቀት ውስጥ ብዙ የ PCR ምላሽ ስርዓቶችን ለማዘጋጀት ትልቅ ምቾት ይሰጣል።
2. RT-PCR
RT-PCR (የተገላቢጦሽ ግልባጭ PCR) ከኤምአርኤን ወደ ሲዲኤን ለመቀየር እና ለማጉላት እንደ አብነት ለመጠቀም የሙከራ ዘዴ ነው።የሙከራ ሂደቱ በመጀመሪያ በቲሹዎች ወይም በሴሎች ውስጥ ያለውን አጠቃላይ አር ኤን ማውጣት፣ ኦሊጎ (ዲቲ)ን እንደ ፕሪመር መጠቀም፣ ሲዲኤንኤን ለማዋሃድ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴዝ መጠቀም እና ከዚያም ሲዲኤንኤን እንደ አብነት መጠቀም ለ PCR ማጉላት የታለመውን ዘረ-መል ለማግኘት ወይም የጂን አገላለፅን ማግኘት ነው።
3. Fluorescent quantitative PCR
የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR (የእውነተኛ ጊዜ መጠናዊ PCR፣RT-qPCR) የፍሎረሰንት ቡድኖችን ወደ PCR ምላሽ ሥርዓት የመጨመር ዘዴን የሚያመለክት ሲሆን የፍሎረሰንት ምልክቶችን ክምችት በመጠቀም አጠቃላይ የ PCR ሂደቱን በቅጽበት ለመከታተል እና በመጨረሻም አብነቱን በቁጥር ለመተንተን መደበኛውን ኩርባ በመጠቀም።በብዛት ጥቅም ላይ የዋሉ የqPCR ዘዴዎች SYBR Green I እና TaqMan ያካትታሉ።
4. የተከተተ PCR
Nsted PCR ለሁለት ዙር PCR ማጉላት ሁለት የ PCR ፕሪመርቶችን መጠቀምን የሚያመለክት ሲሆን የሁለተኛው ዙር የማጉላት ውጤት ደግሞ የታለመው የጂን ቁርጥራጭ ነው።
የመጀመሪያዎቹ ጥንድ ፕሪመር (ውጫዊ ፕሪምሮች) አለመመጣጠን ልዩ ያልሆነ ምርት እንዲጨምር ካደረገ ፣ የተወሰነ ያልሆነ ክልል በሁለተኛው ጥንድ ፕሪመር እውቅና የማግኘት እና የማጉላት እድሉ በጣም ትንሽ ነው ፣ ስለሆነም በሁለተኛው ጥንድ ፕሪመር ማጉላት, የ PCR ልዩነት ተሻሽሏል.ሁለት ዙር PCR የማከናወን አንዱ ጥቅም ከተገደበ መነሻ ዲኤንኤ በቂ ምርትን ለማጉላት ይረዳል።
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR የ PCR ዑደት መለኪያዎችን በማስተካከል የ PCR ምላሽን ልዩነት ለማሻሻል ዘዴ ነው.
በንክኪ PCR ውስጥ፣ ለመጀመሪያዎቹ ጥቂት ዑደቶች የማደንዘዣው የሙቀት መጠን ከፕሪምየርስ ከፍተኛው የሙቀት መጠን (ቲኤም) በላይ በጥቂት ዲግሪዎች ይዘጋጃል።ከፍተኛ የማደንዘዣ ሙቀት ልዩ ያልሆነ ማጉላትን በትክክል ሊቀንስ ይችላል, ነገር ግን በተመሳሳይ ጊዜ, ከፍ ያለ የአየር ሙቀት መጨመር የፕሪሚየር እና የዒላማ ቅደም ተከተሎችን ልዩነት ያባብሳል, በዚህም ምክንያት የ PCR ምርት ይቀንሳል.ስለዚህ, በመጀመሪያዎቹ ጥቂት ዑደቶች ውስጥ, በስርዓቱ ውስጥ የታለመውን ዘረ-መል (ጅን) ይዘት ለመጨመር ብዙውን ጊዜ የማደንዘዣው ሙቀት በአንድ ዑደት በ 1 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ይቀንሳል.የማስታወሻው የሙቀት መጠን ወደ ጥሩው የሙቀት መጠን ሲቀንስ, የቀዘቀዘው የሙቀት መጠን ለቀሪዎቹ ዑደቶች ይቆያል.
6. ቀጥተኛ PCR
ቀጥተኛ PCR የኒውክሊክ አሲድ ማግለል እና ማጽዳት ሳያስፈልገው በቀጥታ ከናሙናው በቀጥታ የዒላማ ዲኤንኤ ማጉላትን ያመለክታል።
ሁለት ዓይነት ቀጥተኛ PCR አሉ፡-
ቀጥተኛ ዘዴ: ትንሽ መጠን ያለው ናሙና ይውሰዱ እና በቀጥታ ወደ PCR Master Mix ለ PCR መለያ ይጨምሩ;
ስንጥቅ ዘዴ-ናሙናውን ከወሰዱ በኋላ ወደ ሊዛት ይጨምሩ ፣ ጂኖም ለመልቀቅ ሊሴ ፣ ትንሽ የሊዝድ ሱፐርኔታንት ይውሰዱ እና ወደ PCR Master Mix ይጨምሩ ፣ PCR መታወቂያ ያከናውኑ።ይህ አካሄድ የሙከራውን የስራ ሂደት ያቃልላል፣ በእጅ የሚሰራውን ጊዜ ይቀንሳል፣ እና በንጽህና ደረጃዎች የዲኤንኤ ብክነትን ያስወግዳል።
7. SOE PCR
የጂን ስፔሊንግ በተደራራቢ ኤክስቴንሽን PCR (SOE PCR) ፒሲአር ምርቶች ተደራራቢ ሰንሰለቶች እንዲፈጠሩ ለማድረግ ተጨማሪ ጫፎችን በመጠቀም ፕሪመርን ይጠቀማል፣ ስለዚህም በቀጣይ የማጉላት ምላሽ፣ በተደራረቡ ሰንሰለቶች ማራዘሚያ የተለያዩ የA ቴክኒካል ምንጮች የተጨመሩ ቁርጥራጮች የሚደራረቡበት ነው። እና አንድ ላይ ተጣብቀዋል.ይህ ቴክኖሎጂ በአሁኑ ጊዜ ሁለት ዋና የትግበራ አቅጣጫዎች አሉት-የመዋሃድ ጂኖች ግንባታ;የጂን ሳይት-ተኮር ሚውቴሽን.
8. IPCR
ተገላቢጦሽ PCR (IPCR) ከሁለቱ ፕሪመርሮች ውጭ ያሉ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ለማጉላት የተገላቢጦሽ ማሟያ ፕሪመርን ይጠቀማል፣ እና በሚታወቀው የዲኤንኤ ክፍልፋይ በሁለቱም በኩል የማይታወቁ ቅደም ተከተሎችን ያጎላል።
IPCR በመጀመሪያ የተነደፈው በአቅራቢያው ያሉትን የማይታወቁ ክልሎች ቅደም ተከተል ለመወሰን ነው, እና በአብዛኛው የጂን አራማጅ ቅደም ተከተሎችን ለማጥናት ያገለግላል;እንደ ጂን ውህደት ፣ ትራንስፎርሜሽን እና ሽግግር ያሉ ኦንኮጅኒክ ክሮሞሶም ማሻሻያ;እና የቫይራል ጂን ውህደት፣ እንዲሁም አሁን በብዛት ጥቅም ላይ ይውላሉ ለሳይት-ተኮር ሚውቴሽን፣ ፕላዝማይድ ከተፈለገው ሚውቴሽን ጋር ይቅዱ።
9. ዲፒሲአር
ዲጂታል PCR (dPCR) የኒውክሊክ አሲድ ሞለኪውሎችን ፍፁም የመጠን ዘዴ ነው።
በአሁኑ ጊዜ የኒውክሊክ አሲድ ሞለኪውሎችን ለመለካት ሦስት ዘዴዎች አሉ.ፎቶሜትሪ በኒውክሊክ አሲድ ሞለኪውሎች ላይ በመምጠጥ ላይ የተመሰረተ ነው;የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR (ሪል ታይም ፒሲአር) በሲቲ እሴት ላይ የተመሰረተ ነው፣ እና የሲቲ እሴቱ ሊታወቅ ከሚችለው የፍሎረሰንት እሴት ጋር የሚዛመደውን ዑደት ቁጥር ያመለክታል።ዲጂታል PCR በነጠላ ሞለኪውል PCR ዘዴ ላይ የተመሰረተ የቅርብ ጊዜ የቁጥር ቴክኖሎጂ ነው ኑክሊክ አሲድ ለመቁጠር ፍፁም የቁጥር ዘዴ ነው።
የልጥፍ ሰዓት፡- ሰኔ-13-2023